Medio de cultivo.

El medio de cultivo es la combinación sólida o líquida de nutrientes y agua. Usualmente incluye sales inorgánicas, carbohidratos y vitaminas y aminoácidos. A menudo se denomina Medio Basal y puede ser suplementado con algún regulador de crecimiento y ocasionalmente con otras sustancias varias.
Solución que cuenta con los nutrientes necesarios para recuperar, multiplicar, aislar e identificar los microorganismos (bajo condiciones favorables de temperatura y pH), así como efectuar pruebas de susceptibilidad. Generalmente se presentan desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser preparados, al prepararse podemos encontrarlos en estado sólido, semisólido y líquido.

1. Introducción

El propósito de los medios de cultivo es respaldar el desarrollo de los m.o y exhibir una morfología colonial y microscópica típica. Será pues necesario la utilización de medios de cultivo para:

- Separación y aislamiento de m.o

- Como paso previo para el estudio de su identificación

- Conocer el metabolismo

- Estudios macroscópicos

- La realización de antibiogramas

- Pruebas de CMI (Concentración mínima inhibitoria)

- Para la conservación de especies

Las variaciones en la composición del medio pueden alterar estas características. Las condiciones que ha de cumplir un medio de cultivo son:

a) Una composición de nutrientes adecuada a las necesidades de ese microorganismo. Como fuentes de energía tenemos:

a. Fuente de carbono: Algunas bacterias son capaces de utilizar sustancias muy sencillas, otras azucares simples y complejos, otros gas carbónico, hidrocarburos o incluso hidrocarbonados diferentes.

b. Fuente de nitrógeno: Esta fuente de energía la van a formar las proteínas, péptidos o aminoácidos.

Otros requerimientos no energéticos de los m.o son:

a. Fuentes de azufre: Lo hacen mayoritariamente en forma de sulfatos .

b. Fuente de fósforo: En forma de fosfatos

c. Iones metálicos: A concentraciones muy bajas (cinc, manganeso, cobre, cobalto, molibdeno)

d. Factores de crecimiento: Corresponden a algún tipo de aminoácido (cisteína), factores específicos (F. X o F. V) o incluso vitaminas o bases púricas, pirimídicas,…

e. Factores de arranque: Son sustancias que van a permitir a la bacteria salir de su fase de latencia. Esto se consigue con glucosa o iones que estimulen su crecimiento.

f. Factores inhibidores: Son componentes que van a impedir el crecimiento como la azida sódica (gran-), los antibióticos, la eosina azul de metileno (gram +)

b) Condiciones físico-químicas apropiadas:

a. Temperatura óptima: Hay tres tipos de bacterias dependiendo del grado de temperatura a las que crezcan:

* Psicrófilas: <>

* Mesófilas: 18-45ºC

* Termófilas: > 45ºC

b. Grado de humedad: La cantidad de agua que va a necesitar el m.o para su desarrollo. La liofilización o cualquier método de deshidratación es un buen medio de conservación.

c. pH: Los buffers o tampones son los encargados de estabilizar el pH del medio a un pH cercano a la neutralidad que es el pH óptimo, aunque hay m.o que crecen mejor en pH ácidos (tiobacilos) o pH alcalinos (Proteus o Vibrio cholerae)

d. Presión osmótica: En condiciones de isotonía (300 miliosmoles), aunque hay bacterias halófilas en las cuales su crecimiento se produce en concentraciones muy altas de cloruro sódico (10%) como el Género Staphylococcus; o en condiciones osmófilas en las que requieren un 70% de azúcar.

e. Presencia o ausencia de oxígeno

2. Clasificación de los medios de cultivo

- Según su estado físico:

o Sólido: Se utiliza un agente solidificante (el agar) en una proporción por encima del 15% (12-15 g/L). En ellos las bacterias crecen con mayor dificultad, pues los nutrientes se agotan con rapidez en el punto donde se desarrollan no obstante nos permite el aislamiento, purificación y visualización de su crecimiento en colonias, así como su posible identificación a través de medios específicos y diferenciales de caracteres sólidos, elaboración de antibiogramas, etc.

o Semisólido: Presentan agar en su composición e una proporción menor al 5% (2,5g/L). Se utiliza especialmente para el estudio de algunas propiedades bioquímicas (oxidación-fermentación)

o Líquido: No contienen ningún tipo de agente solidificante y son también denominados caldos. Favorecen mucho el desarrollo y multiplicación de las bacterias porque al difundirse éstas por todo el medio encuentran con facilidad las sustancias que necesitan para nutrirse. Se de gran utilizad para la realización de múltiples pruebas.

- Según su composición

o Medios naturales: Aparecen sustancias orgánicas e inorgánicas que se presentan de manera natural.

o Medios semisintéticos: Aparecen moléculas naturales hidrolizadas.

o Medios sintéticos: Aparecen sustancias químicas definidas. Son los más utilizados y siempre deberán contenter:

* Fuente de carbono o azúcar

* Una fuente de nitrógeno

* Compuestos minerales, y entre ellos, oligoelementos

* Factores de crecimiento

o Medios complejos: Su composición no está exactamente definida. Su uso está restringido (sólo en virología y parasitología)

- Según el uso a que se destinan

o Medios para aislamiento: Se pueden obtener a partir de ellos colonias aisladas. Según sea su composición se dividen en:

* Medios enriquecidos: Medios con un nutriente simple que presentan enriquecedores destinados a desarrollar m.o muy exigentes.

* Medios selectivos: Contienen componentes que inhiben el desarrollo de ciertos m.o, lo cual les permite aislar una determinada especie o evitar la presencia de agentes contaminantes.

* Medios diferenciales: Contienen componentes que inhiben el desarrollo de ciertos m.o y presentan colorantes, azúcares e indicadores, concebidos para provocar una respuesta bioquímica conocida, generalmente el color, lo cual permite aislar una determinada especie o evitar agentes contaminantes.

o Medios para crecimiento general: También llamados comunes, son apropiados para el cultivo de la mayoría de los m.o por la facilidad con que se desarrollan en ellos.

o Medios de identificación: Nos van a servir para identificar el crecimiento y características de algún tipo de m.o. También nos servirá fundamentalmente para clasificar taxonómicamente el m.o

o Medios de mantenimiento de cepas: Son medios no nutrientes, semisólidos muy reductores que inhiben las reacciones enzimáticas y evitan los efectos letales de la oxidación para mantener a las cepas vivas durante periodos de tiempo largos. La leche descremada que congelada se utiliza a menudo para mantener cepas durante meses

- Según su presentación

o Medios deshidratados o liofilizados: Son medios que se comercializan tal cual y una vez en el laboratorio deben ser preparados adicionando la cantidad de agua correspondiente en condiciones totalmente asépticas.

o Medios ya preparados: Elaborados por las casas comerciales presentando un determinado control de calidad y características específicas adecuadas a cada tipo de cultivo.

o Medios sólidos en placa Petri: Son medios sólidos que ocupan una superficie lo suficientemente grande como para poder visualizar perfectamente las colonias microbianas.

o Medios sólidos en tubo: Corresponden a tubos con agar inclinado y solidificado con el fin de aumentar la superficie donde se va a producir el crecimiento microbiano una vez sembrado. Son útiles para observar el crecimiento aerobio microbiano si se ha sembrado por estría, el crecimiento anaerobio microbiano si se ha sembrado por picadura (anaerobiosis facultativa) y para la conservación de cepas.

o Medios líquidos en tubo: No permiten visualizar colonias sino que sirven para realizar pruebas bioquímicas o para aumentar la concentración del m.o inoculado. Estos medios no contienen agar.

o Medios semisólidos en tubo: Se siembran por picadura y se utilizan en ciertas pruebas bioquímicas como la prueba de la movilidad, la prueba de oxidación-fermentación,…

o Medios de doble fase en frasco o tubo: Constituidos por una fase sólida y otra líquida. Suelen contener obturadores de caucho manteniendo completamente aislado el medio.

3. Principales medios utilizados en microbiología

- Agua peptonada: Compuesta de peptona en medio acuoso de pH7. Está indicada para la determinación de la producción de indol debido a su alto contenido en triptófano (positivo si aparece un anillo rojo en la superficie)

- Agar lactosado con púrpura de bromocresol: Compuesta fundamentalmente por lactosa y púrpura de bromocresol. Se emplea para el aislamiento de coliformes (enterobacterias lactosa positiva que provoca el viraje del púrpura de bromocresol a amarillo)

- Caldo de bilis y verde brillante: Compuesta de bilis de buey, peptona, lactosa y verde brillante, sirve para el aislamiento e identificación de coliformes en la leche y otros alimentos (la bilis y el verde inhiben el crecimiento de las gran + y alguna – y la lactosa positiva produce gas)

- Medio base Bordet-Gengou: Compuesta por cloruro sódico y peptona fundamentalmente sirve para el aislamiento de Bordetella pertussis (tosferina) que forman colonias parecidas a gotitas de mercurio.

- Agar Brucella modificado: Está compuesto fundamentalmente por etil violeta y antibióticos que inhiben el crecimiento de los demás m.o como la bacitracina y la ciclohexamida.

- Medio Chapman o Sal-Manitol: Compuesta fundamentalmente por rojo fenol, D-manitol y concentraciones altas de cloruro sódico. Sirve para el aislamiento de especies del género Staphylococcus.

- Medio para Hemophillus (Agar chocolate polyvitex): Compuesto por agar chocolate Polyvitex. Se utiliza para el aislamiento y estudio del Género Haemophyllus (colonias con amplio halo de hemólisis)

- Medio base Christensen: Compuesto fundamentalmente por urea y rojo fenol. Se utiliza para la prueba de la ureasa (positivo vira a rosa intenso)

- Medio citrato de Simmons: Compuesto fundamentalmente por citrato sódico. Se utiliza para hacer la prueba de citrato (los m.o que utilizan citrato viran a azul)

- Medio Clark y Lubs: Prueba de Voges-Proskauer

- Medio Cled: Sirve para el recuento e identificación de gérmenes en las vías urinarias (E. coli, Proteus, P. aeruginosa, S. faecalis, S. aureus)

- Agar sangre o medio agar Columbia: Su principal compuesto es la sangre de cordero. Es un medio adecuado para el aislamiento de estreptococos y pneumococos (en la prueba se dan los tres tipos de hemolisis)

- Agar D-Cocosel: Sirven para el aislamiento de enterococos del grupo D por lo que en su composición lleva azida sódica para inhibir los gram- (positivo en colonias traslúcidas rodeadas por un halo negro)

- Agar desoxicolato citrato : Sus componentes principales son el desoxicolato sódico y el citrato ya que van a inhibir los gérmenes Gram+ y ciertos Gram – sirviendo de aislante de enterobacterias patógenas ( colonias transparentes, rojas, anarajadas rojizas o amarillas)

- Medio agar DCLS (dexicolato-citrato-lactosa-sacarosa): Los compuestos principales son el tiosulfato sódico, el desoxicolato sódico y el citrato. Sirve para aislar salmonella, shigella (transparente rosáceas) y vibrio (colonias rojas)

- Medio de agar Endo: Sus compuestos principales son la lactosa y la fuchsina básica. Sirve para el aislamienteo de coliformes (colonias incoloras de bacterias gran- lactosa-) y de enterobacterias (rosas o rosadas lactosa +)

- Medio Levine (eosina azul de metileno): Sus componentes fundamentales son la eosina y el azul de metileno. Se utiliza para diferenciar las enterobacterias coliformes (lactosa +) y las no coliformes (lactosa – colonias transparentes Salmonella y Shigella)

- Medio Kliger o Kia (Kliger Iron Agar): Los componentes principales son la glucosa, el rojo fenol y la lactosa. Sirve para realizar la prueba de la lactosa (amarillo en la parte superior), glucosa (amarillo solo una zona), gas (cámara de aire o agar roto) y SH₂ (precipitado negro).

- Caldo lactosado: Los principales componentes son la lactosa y el púrpura de bromocresol. Sirve para el aislamiento de coliformes y gérmenes lactosa positivo (vira a amarillo)

- Medio Loeffler: Sirve para la determinación del bacilo diftérico (Corinebacterium diptheriae) ya que a las 24 horas aparece una superficie blanquecina.

- Medio MacConckey: Los principales compuestos son las sales biliares y el cristal violeta, ya que se ocupan de inhibir a los gérmenes Gram+. Sirve para el aislamiento e identificación de enterobacterias. En este medio nos pueden salir colonias rojas o rosadas (E.coli), incoloras (Salmonella, Shigella y Pseudomonas), rosadas y mucosas (Enterobacter aerogenes)

- Medio Mueller Hinton: Se les suele añadir una mezcla de VCN (Vancomicina.Colimicina.Nistatina) para inhibir el crecimiento de los m.o q no sean meningococos o gonococos. Sirve como ya hemos dicho para el aislamiento de Neisserias y para la realización de antibiograma.

- Medio agar nutritivo: Es para cultivo de gérmenes en general por lo que sus compuestos están habilitados para todo tipo de m.o

- Medio caldo F-Selenito: Su compuesto principal es el selenito sódico que sirve de alimento para el aislamiento de Salmonella.

- Medio agar S-S: Los componentes principales son la lactosa (crea colonias rojas o rosadas las +), el tiosulfato sódico y el citrato férrico (precipitado negro + en SH₂, Salmonella) y las sales biliares que inhibirán a todos los m.o gram +. Cuando no reacciona nada y aparecen unas colonias incoloras deberemos saber que son Shigellas.

- Medio agar verde brillante: Los compuestos fundamentales son la lactosa, la sacarosa (positivas en m.o no Salmonella de color verdoso) y el rojo fenol (vira a rojizo o rosa con la presencia de Salmonella). Sirve para el aislamiento de la Salmonella, excepto Salmonella typhi y Salmonella paratyphi

- Medio Agar XLD (agar xilosa, lisina.dexicolato): Los compuestos principales son la L-lisina, el rojo fenol, el tiosulfato sódico, el citrato de hierro y azúcares (lactosa, glucosa y xilosa). Sirve para aislar enterobacterias patógenas. Para hacer la lectura hay que seguir los siguientes criterios:

o La descarboxilación de la lisina: colonias rojas característico de Shigella

o Fermentación de azúcares: Colonias amarillas tipos de Escherichia, Citrobacter, Serratia, Proteus, Enterobacter y Kelbsiela.

o Producción de SH₂ (debido a tiosulfato sódico y citrato férrico): colonias negras típico en Salmonella SH₂ +, Arizona, Proteus y Edwardsiella.

- Medio Castañeda: Contiene sustancias inhibidoras de la posible actividad bactericida. Sirve para la identificación de Brucella, Vibrios y Pasteurella en sangre (presencia de turbidez, hemolisis y gas)

- Medio Löwensteins-Jensen: Sus componentes principales son la fécula de patata (sirve como enriquecimiento del medio específico para micobacterias) y verde malaquita o rojo congo (inhiben el crecimiento de la mayor parte de las bacterias). Sirve para el cultivo de Mycobacterium tuberculosis y otras micobacterias.

- Medio Sabouraud: Su compuesto principal es la glucosa que está en altas concentraciones lo que impide el crecimiento bacteriano. Sirve para el aislamiento e identificación de hongos que suelen tener un aspecto algodonoso.

Clasificación

Según su aspecto físico:

• fosiferoliquidos
• Semi-sólidos
• Sólidos duros o muy duros

Según su uso:

• Selectivos
• Selectivos de enriquecimiento
• Diferenciales
• Para cultivar gérmenes anaerobios
• Para medir potencia de antibióticos
• De transporte en micro
• Para filtración a través de membrana
• Para cultivo de hongos y levaduras
• Para cultivo de protozoarios